Ожог плодовых культур в РФ и современные подходы к его диагностике

Ожог плодовых культур — одно из опаснейших эпифитотийных заболеваний, поражающих растения сем. Розоцветные. Его возбудитель энтеробактерия Erwinia amylovora вызывает некрозы всех органов растений-хозяев. В Российской Федерации заболевание относится к ограниченно распространенным карантинным видам. Очаги ожога официально зарегистрированы в 13 регионах Европейской части РФ. В статье приведены основные результаты продолжающихся исследований возбудителя, проводящихся в ФГБУ «Всероссийский центр карантина растений». Особое место отводится совершенствованию лабораторной диагностики E. amylovora, необходимой для надежного выявления возбудителя в растительном материале.

Введение

Бактериальный ожог плодовых культур (возб. Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al.) — одно из наиболее опасных заболеваний растений семейства Rosaceae. К настоящему времени возбудитель, впервые выявленный в 1780-х гг. в США, проник во многие регионы Северного полушария, а также в Новую Зеландию [1]. В регионе Европейской и Средиземноморской организации по карантину и защите растений (ЕОКЗР) и в РФ ожог входит в списки ограниченно распространенных карантинных объектов. В связи с огромным экономическим значением E. amylovora является одной из наиболее изучаемых фитопатогенных бактерий в мире. Специалисты ФГБУ ВНИИКР принимают участие в международных проектах, работают в группах ЕОКЗР, используют международный опыт в отношении бактериального ожога. Однако в связи с пространственно-климатическими и другими особенностями организации, подведомственные Россельхознадзору, сталкиваются с проблемами, требующими собственных научных и методических подходов. В этой связи в ФГБУ ВНИИКР проводятся работы по следующим основным направлениям: мониторинг территории РФ, совершенствование диагностики E. amylovora, изучение биологии и эпифитотиологии возбудителя, устойчивости сортов растений-хозяев, испытание препаратов против бактериального ожога.

Географическое распространение бактериального ожога в РФ

Впервые в РФ ожог был выявлен в 2003 г. в Калининградской области [2]. В 2007 г. очаги были обнаружены в Воронежской области [3]. С 2008 г. специалисты ФГБУ ВНИИКР совместно с территориальными управлениями Россельхознадзора проводят мониторинг территории РФ, в ходе которого к настоящему времени выявлены очаги в Белгородской, Брянской, Волгоградской, Воронежской, Калининградской, Липецкой, Пензенской, Самарской, Саратовской, Смоленской, Тамбовской областях, Краснодарском и Ставропольском краях, Республиках Дагестан, Кабардино-Балкария, Крым и Карачаево-Черкесской Республике [4-7]. Кроме того, в ходе проведения научных работ заболевание было выявлено в г. Москва и Орловской области, зараженные образцы были получены от граждан из Ростовской области и Республики Северная Осетия — Алания. К началу 2019 г. в РФ установлено 60 фитосанитарных зон общей площадью 225 804,83 га [8]. По данным территориальных управлений Россельхознадзора, очаги ожога были ликвидированы в Брянской и Волгоградской областях, а также в Республике Кабардино-Балкария.

Изучение эпифитотиологии бактериального ожога

Изучение особенностей жизненного цикла, путей распространения, потенциальной вредоносности бактериального ожога на территории РФ проводится с 2014 г. По нашим наблюдениям, скорость распространения и вредоносность заболевания зависят от особенностей климата, плотности и восприимчивости насаждений растений-хозяев, а также в немалой степени от агротехники. Как правило, боярышник, груша и айва обыкновенная сильно поражаются во всех регионах произрастания. В отношении яблони и других культур в целом отмечаются значительные различия в динамике заболевания в зонах с морским и умеренным климатом (Калининградская область, Северный Кавказ и Предкавказье) и в континентальных регионах (район Нижней Волги); в областях ЦФО вредоносность в целом снижается в направлении с северо-запада на юго-восток [5, 6].

В Нижнем Поволжье (Самарская, Саратовская и Волгоградская области), где преобладает континентальный климат, на яблоне характерна периодичность формирования симптомов по годам, их развитие в более поздние сроки по сравнению с более умеренными областями, в целом их меньшее проявление. В 2015 г. наблюдалось резкое снижение численности популяции E. amylovora в зимний период и быстрое наступление жаркого, засушливого вегетационного периода, что не позволило патогену восстановить численность, достаточную для формирования симптомов заболевания. В 2017 г., несмотря на высокий инфекционный фон в начале вегетации после вспышки 2016 г, наблюдалось отсутствие эпифитотии из-за экстремально затяжной холодной весны, что дало возможность побегам яблони пройти наиболее восприимчивую стадию роста. Таким образом, изучение динамики заболевания в условиях различных регионов РФ позволит прогнозировать ущерб и рекомендовать адекватные меры борьбы с ним. 

Изучение путей распространения возбудителя и возможность определения источника инфекции в каждом конкретном случае — крайне важная задача для карантина растений. На практике не всегда удается документально установить происхождение посадочного материала. Тем более это затруднительно в случае заражения дикорастущих растений-хозяев.

Наиболее эффективным методом установления родства бактериальных штаммов признано их генотипирование. Вследствие недавнего глобального распространения Е. amylovora генетическое сходство различных групп штаммов составляет 99,4-99,98% [9], особенно в Европе, где разнообразие мало [10]. Для генотипирования штаммов Е. amylovora предложено использовать полиморфизм кластерных регулярно расположенных коротких палиндромных повторов (CRISPR) [11] и MLVA (мультилокусный анализ переменного числа тандемных повторов, VNTR) [12]. В 2011-2016 гг. сотрудники ФГБУ ВНИИКР участвовали в проектах по изучению генетических особенностей штаммов возбудителя с использованием методов RFLP-PFGE [13] и CRISPR-анализа [11]. Исследования показали, что Е. amylovora проникала в Старый Свет как минимум 2 раза и представлена так называемыми польской и средиземноморской макрогруппами штаммов [11]. 

На территории РФ в Калининградской области распространены штаммы, близкие к польским, в ЮФО — штаммы, близкие к средиземноморской группе. В центральных районах Европейской части РФ встречаются обе группы [14].

Применение MLVA позволяет разделять штаммы на более локальные группы. Дополнительное использование анализа участков VNTR позволило установить, что штаммы польской группы, распространенные в центральных регионах и в Калининградской области значительно отличаются. Более того, штаммы этой группы из ЦФО не встречались среди более чем 800 штаммов из всемирной коллекции [4]. Они были выявлены в 2008 г. в Мичуринске на территориях коллекционных и производственных участков ВНИИС им. Мичурина и ВНИИГиС им. Мичурина. В дальнейшем именно они наиболее часто встречались в молодых промышленных и частных садах Воронежской, Липецкой, Пензенской, Самарской областей, что указывает на их распространение с посадочным материалом и на недостаточный контроль качества саженцев в этих регионах. Для более детального типирования штаммов начаты работы по секвенированию и сравнению полных CRISPR-регионов, а также изучение дополнительных участков VNTR.

Изучение устойчивости сортов яблони к бактериальному ожогу

На территории РФ бактериальный ожог выявлялся на яблоне, груше, боярышниках, айве обыкновенной, а в Калининградской области также на сливе домашней и ирге. Наибольший экономический интерес представляет яблоня, насаждения которой в последние годы быстро расширяются. Данные об устойчивости отечественных сортов этой культуры крайне отрывочны, что не позволяет рекомендовать подходящий сортимент для промышленных и частных садов в регионах с повышенным риском их заражения ожогом. Отдельную проблему мирового масштаба в настоящее время представляет поиск замены технологичного, но крайне восприимчивого к ожогу подвоя М9. В испытаниях устойчивости деревьев, привитых на подвой М9 и искусственно зараженных через цветки, было получено от 36 до 100 % выпадов из-за гибели подвоя [15]. Массовая гибель деревьев наблюдается в Казахстане. В настоящее время совместно с ФГБОУ ВО Мичуринский ГАУ (г. Мичуринск) начаты исследования устойчивости сортов и подвоев яблони к ожогу методом выявления ДНК-маркеров количественной устойчивости [16, 17], а также in vivo на саженцах в карантинной теплице ФГБУ ВНИИКР.

Испытание препаратов против бактериального ожога

В России в настоящее время против бактериального ожога зарегистрирован препарат «Фитолавин» (РВК). В 2017 г. были проведены испытания препаратов in vitro. «Фитолавин» (РВК), «Фармайод» (ГР) [7], «Зерокс» «Нано-биотех», «Хом» «ЦСП Техноэкспорт» показали высокую эфективность. В 2019 г. запланированы их испытания на саженцах яблони в карантинной теплице ФГБУ ВНИИКР.

Диагностика возбудителя бактериального ожога плодовых культур

В целом диагностика E. amylovora хорошо разработана. Вышла вторая редакция диагностического стандарта ЕОКЗР [18], в карантинных лабораториях России исследование образцов проводится в соответствии с Методическими рекомендациями [19], гармонизированными с диагностическим стандартом [18]. При исследовании образцов с типичными симптомами в период их активного развития трудностей с выявлением, изоляцией и идентификацией патогена не возникает. Однако такие образцы доступны только при проведении мониторинга. Большая часть продукции (саженцы), а также образцы, отобранные при мониторинге, представляют собой растительный материал без симптомов или со слабо выраженными симптомами. Зачастую посадочный материал поступает в осенне-зимне-весенний период, образцы могут отбираться от обработанных растений и т. д. Поэтому на практике прямое применение схемы лабораторного исследования, предложенного стандартами ЕОКЗР, возможно не всегда. Возникает необходимость постоянного совершенствования методов диагностики, которые позволяли бы надежно и быстро выявлять возбудителя в образцах с латентной инфекцией.

Наиболее полно этим требованиям отвечают тесты на основе различных модификаций ПЦР. В диагностическом стандарте [18] предложены ПЦР-тесты с праймерами к участкам бактериальной хромосомы и к присутствующей у подавляющего большинства штаммов плазмиде рЕА29. На их основе в ФГБУ ВНИИКР были отработаны и валидированы тесты с использованием отечественных коммерческих наборов. Для выделения ДНК использовали набор «Проба ГС» (ООО «Агродиагностика», АД). В качестве рутинных отборочных тестов для амплификации ДНК, выделенной из растительного экстракта, используют готовые коммерческие наборы для ПЦР-РВ «Бактериальный ожог плодовых Erwinia amylovora» (АД) (или тот же набор в формате FLASH) с коммерческими олигонуклеотидами к плазмиде рЕА29, а также «Фитоскрин Erwinia amylovora-РВ»» («Синтол») или «Базовый комплект No 2 с ВК» (АД) с праймерами и зондом по Gottsberger (2010) [18] к участку бактериальной хромосомы. Готовые наборы предпочтительны в использовании, так как снижаются трудоемкость и продолжительность тестирования, а также влияние на результат человеческого фактора. Наборы включают внутренний положительный контроль амплификации (ВК или ВПК), обязательный к использованию при работе с растительными экстрактами для исключения ложноотрицательного результата из-за ингибирования амплификации.

Если отборочные тесты дают положительный результат, проводят дополнительные тесты на основе классической ПЦР в соответствии со Stöger et al. (2006) [18] (к плазмиде рЕА29) и с Obradovic et al. (2007) [18] (к хромосоме). Тесты валидированы с набором 5хScreenMix-HS («Евроген») без ВК, для которого необходимо проводить реакцию в отдельной пробирке. Продукты пригодны для последующего секвенирования. Необходимо отметить, что продукт ПЦР в соответствии со Stöger et al. (2006) [18] содержит 8-нуклеотидные минисателлиты. Длина ампликона известных штаммов варьирует от 350 до 430 п. о. (от 0 до 10 повторов). В нашем исследовании также был получен неспецифичный продукт длиной 320 п. о., последовательность которого была идентифицирована как фрагмент близкого непатогенного вида E. billingiae. Для достоверного установления присутствия ДНК E. amylovora необходимо получить положительные результаты не менее чем 3 тестов с различными праймерами. Таким образом, была создана схема быстрого и надежного исследования образцов, основанная на применении высокочувствительных ПЦР-тестов для включения в обновленные методические рекомендации ФГБУ ВНИИКР.

Полный список.

Подготовлено по материалам, опубликованным в журнале «Плодоводство и ягодоводство России» (2019 г., том 58).